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顯微鏡分辨率：概念、因素和計算
發(fā)布時間：2021-09-01
分辨率與數(shù)值孔徑
數(shù)值孔徑（NA）與光通過的介質(zhì)的折射率（n）以及給定物鏡的孔徑角（α）有關(guān)（NA=n × sin α）。顯微鏡的分辨率不僅取決于物鏡的NA，還取決于整個系統(tǒng)的NA，要把顯微鏡聚光鏡的NA也納入考慮。在顯微鏡系統(tǒng)中，所有光學(xué)元件都正確對齊、具有相對較高的NA值并且相互協(xié)調(diào)工作，可以分辨出更多的圖像細(xì)節(jié)。分辨率還與標(biāo)本成像所用的光波長有關(guān)；波長越短，可分辨的細(xì)節(jié)越多，波長越長則分辨細(xì)節(jié)越少。
在處理分辨率時需要考慮三個數(shù)學(xué)概念：‘阿貝衍射極限’、‘艾里斑’和‘瑞利判據(jù)’。以下按時間順序逐一介紹。
George Biddell Airy與‘艾里斑’（1835）
George Biddell Airy（1801-1892）是英國數(shù)學(xué)家和天文學(xué)家。1826年，25歲的他被任命為三一學(xué)院的數(shù)學(xué)教授，兩年后，被任命為新劍橋天文臺的天文學(xué)教授。1835年到1881年期間，他是“皇家天文學(xué)家”，月球和火星上各有一處以他的名字命名的隕石坑。
1835年，他在劍橋哲學(xué)學(xué)會學(xué)報上發(fā)表了一篇題為《有關(guān)圓孔徑物鏡的衍射》的論文。Airy在論文中以一個天文學(xué)家的視角描述了通過一個精良的望遠(yuǎn)鏡觀察到的恒星周圍的光環(huán)或者射線的形狀及亮度。盡管是從不同的科學(xué)領(lǐng)域發(fā)表的文章，但這些觀察結(jié)果與其他光學(xué)系統(tǒng)，特別是顯微鏡存在著關(guān)聯(lián)。
艾里斑(Airy Disc)是在衍射限制的系統(tǒng)中由圓形孔徑形成的聚焦的光點。如圖1所示，其呈現(xiàn)為中央亮點和周圍是明暗相間的同心環(huán)（更準(zhǔn)確地說，這是艾里圖案Airy pattern）。
衍射圖案由光的波長和光所通過的孔徑大小決定。艾里斑的中心點含有大約84%的光強(qiáng)，其余16%分布于環(huán)繞該點的衍射圖案中。當(dāng)然，用顯微鏡進(jìn)行觀察時標(biāo)本上會有許多光點，因此基于大量的艾里圖案來考慮，而非如“艾里斑”描述的單個光點來考慮是更妥當(dāng)?shù)姆绞健?/span>
圖1右所示的艾里圖案三維表示又稱為‘點擴(kuò)散函數(shù)’。
圖1：艾里圖案，或稱艾里斑的典型現(xiàn)象，由其中心的理想的光點和環(huán)繞的衍射環(huán)組成。
Ernst Abbe與‘Abbe衍射極限’（1873）
Ernst Karl Abbe（1840-1905）是一位德國數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家。他與Carl Zeiss共同創(chuàng)立了“蔡司光學(xué)工作室”即現(xiàn)在的蔡司公司。除此之外，他還在1884年聯(lián)合創(chuàng)辦了Schott Glassworks。Abbe還是定義數(shù)值孔徑這一術(shù)語的首位學(xué)者。1873年，Abbe發(fā)表了自己的理論和公式對顯微鏡的衍射極限進(jìn)行了解釋。Abbe發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本圖像由許多重疊的、多強(qiáng)度且存在衍射極限的點（或艾里斑）所組成。
要提高分辨率（d=λ/2 NA），標(biāo)本必須使用波長（λ）更短的光來進(jìn)行觀察，或者通過折射率相對高的成像介質(zhì)來進(jìn)行觀察，又或者使用NA較高的光學(xué)組件來進(jìn)行觀察（或者將全部3種因素組合起來）。
但即便將所有這些因素都考慮在內(nèi)，顯微鏡系統(tǒng)的極限依然受到限制，因為系統(tǒng)復(fù)雜性，波長低于400 nm的光在玻璃中的傳播特征，以及整套顯微鏡需要達(dá)到較高的NA。理想光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率限制在200 nm左右，而軸向分辨率約為500 nm（有關(guān)分辨率極限示例，請參見下文）。
John William Strutt與‘瑞利判據(jù)’（1896）
第三代瑞利男爵John William Strutt（1842-1919）是一名英國物理學(xué)家，也是一位高產(chǎn)學(xué)者。他一生編寫了多達(dá)466篇論文，包括430 篇科研論文。他的論文涉獵極廣，各種主題都有，如鳥類飛行、心理研究、聲學(xué)等等。1895年，他發(fā)現(xiàn)了氬并憑借這一發(fā)現(xiàn)于1904年獲得諾貝爾獎。
Rayleigh以George Airy的理論為基礎(chǔ)上并進(jìn)一步延伸，于1896年創(chuàng)造了“瑞利判據(jù)”理論(Rayleigh Criterion)。瑞利判據(jù)（圖2）在衍射極限系統(tǒng)當(dāng)中定義了分辨率極限，換言之，就是何時能夠?qū)?個光點相互區(qū)分或分辨。
使用艾里斑理論，如果2個單獨艾里斑的衍射圖案不重疊，則就可以輕松區(qū)分、‘分辨’兩者并認(rèn)定滿足瑞利判據(jù)（圖2，左圖）。而當(dāng)艾里斑的中心直接重疊于另一個艾里斑的第一理想的衍射圖案時，則兩者認(rèn)定為‘剛好分辨’，同時依然可以區(qū)分為2個獨立的光點（圖2，中圖）。如果艾里斑再繼續(xù)相互接近，則兩者無法滿足瑞利判據(jù)，因此“無法被分辨”為2個不同的光點（或者標(biāo)本圖像中的單獨細(xì)節(jié)；圖2，右圖）。
圖2：分辨率極限（按瑞利判據(jù)來定義），兩個單獨艾里斑的重疊衍射圖案：左圖：分辨良好；中圖：剛好分辨；右圖：未分辨
如何計算顯微鏡的分辨率
將以上全部理論都考慮在內(nèi)就可以明顯看出，在計算分辨率的理論極限時需要考慮很多因素。分辨率還取決于樣本性質(zhì)。我們來看一下使用阿貝衍射極限以及使用瑞利判據(jù)進(jìn)行的分辨率計算。
首先應(yīng)當(dāng)要牢記：
NA= n x sin α
式中n為成像介質(zhì)的折射率，α是物鏡孔徑角的一半。物鏡的理想的孔徑角大約為144º。該角度一半的正弦為0.95。如果使用油浸物鏡且折射率為1.52，則物鏡的理想的NA為1.45。如果使用‘干式’（無浸沒）物鏡，則物鏡理想的NA為0.95（因為空氣的折射率為1.0）。
橫向（即XY）分辨率的阿貝衍射公式為：
d= λ/2 NA
式中λ 是標(biāo)本成像所用的光波長。如果使用514 nm的綠光及NA為1.45的油浸物鏡，則分辨率的（理論）極限將達(dá)到177 nm。
軸向（即Z）分辨率的阿貝衍射公式為：
d= 2 λ/NA2
同樣的，如果我們假設(shè)通過波長514 nm的光來觀察標(biāo)本且物鏡NA數(shù)值為1.45，則軸向分辨率為488 nm。
在阿貝衍射極限的基礎(chǔ)上，瑞利判據(jù)稍稍得到了細(xì)化：
R= 1.22 λ/NAobj+NAcond
式中λ為標(biāo)本成像用的光波長。NAobj 為物鏡NA。NAcond為聚光鏡NA。‘1.22’是一個常系數(shù)。該數(shù)值根據(jù)Rayleigh的貝塞爾函數(shù)研究推導(dǎo)得出。這些主要用于對系統(tǒng)當(dāng)中的問題，例如波的傳遞，進(jìn)行計算。
將聚光鏡的NA考慮在內(nèi)，空氣（折射率為1.0）通常是聚光鏡和玻片之前的成像介質(zhì)。假設(shè)聚光鏡的孔徑角為144º，則NAcond數(shù)值將等于0.95。
如果使用514 nm的綠光，油浸物鏡的NA為1.45，聚光鏡的NA為0.95，則分辨率的（理論）極限將達(dá)到261 nm。
如上所述，用于對標(biāo)本成像的光波長越短，可以分辨的細(xì)節(jié)越多。因此如果使用400 nm的理想的可見光波長，油浸物鏡NA為1.45，聚光鏡NA為0.95，則R等于203 nm。
要在顯微鏡系統(tǒng)當(dāng)中達(dá)到（理論）分辨率的理想值，每個光學(xué)組件都應(yīng)當(dāng)具備理想的可用的NA（把孔徑角納入考慮）。此外，觀察標(biāo)本所用的光波長越短則分辨率越高。最后，整個顯微鏡系統(tǒng)都應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)直對齊。
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