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徠卡共聚焦課堂：光路篇
發布時間：2022-04-14
共聚焦顯微鏡是指一類可以記錄光學切片的特殊光學顯微鏡。
一．共焦照明
通過將光源聚焦在小孔徑（針孔）上，然后聚焦到樣品中，實現點光源照明。當孔徑足夠小時，照明點僅受衍射限制，不受光源和孔徑幾何參數的限制。普通光源是大的面光源，是不可能將其聚焦到衍射極限的光點上。因此，盡管透過率非常低，這種聚焦照明光仍然是十分必要的（對于傳統源）。
圖1：用于共焦成像的照明。來自光源（Ls）的光聚焦于照明針孔（Pi），然后進入樣品S。
激光作為光源具有非常高的準直度（優質激光器提供的光“極度平行”）。因此，在不應用針孔的情況下，激光可以通過單個透鏡聚焦到衍射極限的光點上。因此，大多數共聚焦顯微鏡沒有照明針孔。光點的質量取決于激光的光束質量。如果質量不佳，也可以插入照明針孔。激光通常通過光纖耦合到共聚焦顯微鏡上。這些光纖本身也起針孔的作用。
激光的可聚焦性和高能量密度使其成為共聚焦顯微鏡的理想光源。激光的相干性不是共焦性能所需的特征。相反，這對光學設計師來說是一個挑戰，因為它會引起假的干擾圖案，因而需要謹慎的設計策略。
此外，傳統激光器僅發射單一顏色（激光-“譜線”），這一事實本身也有局限，在多熒光成像和測量時，就需要復雜的多激光排列。白激光很巧妙地解決了多色成像的問題。
圖2：共焦（右側區域）和非共焦成像的比較。在Feulgen染色的小鼠滋養層中。非共焦圖像的很多信息并非來自焦平面。共焦光學消除了所有模糊的因素，使結構變得清晰。
二．共聚焦檢測
大多數探測器具有相當大的敏感區域（光電倍增管通常為幾平方厘米）。共焦光學器件需要點狀探測。因此，必須通過在光束中插入一個小孔徑（針孔）來執行光點檢測。將樣品的光聚焦到該針孔上，收集并記錄透射光。
由于衍射模式取決于數值孔徑和波長，所以必須進行針孔檢測。因此當這些參數改變時，必須調整針孔尺寸。
當物鏡改變時（通常數值孔徑也會隨之改變），現代的共焦掃描顯微鏡會自動適當地改變針孔直徑。因此，針孔通常設計為雙層或多層光圈。
三．共焦掃描的光路
共焦掃描系統中的共聚焦光束路徑只是點光源照明和點探測的結合。這種組合可起到光學切片的效果。只有來自焦平面的光子才能傳遞到傳感器。而來自其他地方的所有光子都被濾除。通過“空間濾波器”的方式實現光學切片。
由于在給定時間內，只有一個光點出現“共聚焦”成像，因此需要一個掃描設備以柵格模式在物場上移動該光點。通常情況下，光學鏡安裝在掃描電機上，用于執行掃描程序。在掃描全幀（通常）1,024行所需的時間方面遇到了瓶頸。通過引入每秒掃描8,000或更多行的高速掃描儀（共振掃描儀），實現了改進。
只有在反射光顯微技術下才能實現良好的光學切片。這是近20年熒光顯微技術蓬勃發展的原因之一（其他原因還包括免疫染色、DNA-雜交、熒光生物傳感器、量子點和熒光蛋白的發明）。
圖4：從左至右：1. 照明錐不僅在焦平面內激發熒光染料，在其上下都會激發。此處用綠色雙錐體表示。2. 發射針孔有效地截斷從焦平面上方發出的光。3. 此外，來自焦平面下方的光也不會通過針孔。4. 在共聚焦系統中，只有來自樣品焦平面的光才會到達檢測器。檢測針孔會有效拒絕來自其他區域的任何光。最終得到真正的光學切面。
