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徠卡共聚焦課堂：無限遠光學系統

發布時間：2022-05-25

從無限遠光學到無限遠接口

“無限遠光學”這一概念是指在顯微鏡的物鏡和鏡筒透鏡之間具有平行光線的光束路徑。平面光學元件可以進入到這個“無限遠空間”中，而不影響成像，這對于利用DIC或熒光等成像方法至關重要。

現代顯微技術需要在無限遠光路中添加多種光學元件，如普通光源或激光。滿足這一需求的不同方法已經出現，本文對其進行了描述。

從安東·范·列文虎克到復式顯微鏡

自公元一世紀羅馬人發明玻璃以來，人們就發現圓形的玻璃珠可以產生放大效果。后來，人們對這種效果進行了科學研究和進一步開發，從而產生了16和17世紀的簡單放大鏡，如漢斯和查卡里亞斯·簡森或安東·范·列文虎克發明的簡單放大鏡。從歷史上看，這是顯微鏡誕生的里程碑。

根據定義，“顯微鏡”是一種可以放大人眼通常無法分辨的物體的儀器，因此這些單透鏡工具已經是顯微鏡了（見圖1上）。如今，當我們談論顯微鏡時，我們想到的是不同的東西。這是因為人們很快就意識到，將兩個單獨的透鏡（或透鏡系統）組合成一排是比單透鏡更有效的視覺工具。

為了描述這種裝置，創造了“復式顯微鏡”這一術語。復式顯微鏡由一個可以放大標本的物鏡和一個可以放大物鏡產生的圖像的目鏡（分別有兩個）組成（見圖1中）。

圖1：上：顯微鏡始于16和17世紀的簡單放大裝置。本例的物鏡是一個可以放大標本的單透鏡。中：有限遠光學復式顯微鏡由雙透鏡系統組成。物鏡放大標本，目鏡放大物鏡產生的圖像。物鏡安裝定位面與目鏡安裝定位面之間的距離稱為機械筒長。下：一個無限遠光學復式顯微鏡帶有一個額外的鏡筒透鏡（TL）。

無限遠光學簡介

物鏡安裝定位面與目鏡安裝定位面之間的距離稱為機械筒長（見圖1中）。為了標準化，19世紀時，英國皇家顯微鏡學會將這一數值設定為160毫米。多年來，這一設計被證實存在一些缺陷。在光路中添加額外的光學元件，例如用于微分干涉成像（DIC）的棱鏡、偏振器等，會改變有效筒長并引入像差，這些必須通過添加其他硬件組件進行校正。

由于這個原因，20世紀30年代時，顯微鏡制造商徠卡開始用無限遠光學進行實驗，這項技術后來被所有其他顯微鏡公司采用。這些無限遠光學系統的物鏡將標本圖像投射到無限遠處，這意味著來自標本一個單點的所有光線都以平行的方式從物鏡中發射出來。在標本（和物鏡）中心的光線與光軸平行。在標本中心以外的光線相互平行，但不與光軸平行。

由無限遠校正的物鏡產生的虛像必須由一個附加透鏡（鏡筒透鏡）捕捉，并進入到目鏡透鏡的前聚焦點（見圖1下）。這種方法使DIC棱鏡等光學儀器可以添加到物鏡和鏡筒透鏡之間的“無限遠空間”中，而不影響成像質量。圖像的位置和聚焦點都沒有改變（見圖2）。

圖2：上：有限遠光學系統由物鏡和目鏡組成。物體被放置在物鏡的單倍焦距和雙倍焦距之間。物鏡產生的中間圖像在目鏡的前聚焦點和目鏡之間聚焦。用戶可以通過目鏡查看圖像。下：在無限遠校正系統中，標本被放置在物鏡的焦距上。在這種情況下，從標本一個點射出的所有光線在物鏡后面都是平行的，就像一個放置在無限遠處的物體。從標本中心射出的光線經過物鏡后平行于光軸（圖中未顯示）。從標本邊緣一個點射出的光線經過物鏡后彼此平行，但不與光軸平行。物鏡與鏡筒透鏡之間的空間稱為無限遠空間。進入這個空間的平面光學裝置幾乎不會影響圖像，因為從標本一個點射出的所有光線都會受到同樣的光學影響。鏡筒透鏡形成的虛像可以通過目鏡查看。

無限遠光學的優點

幾種光學觀察方法需要在顯微鏡的光路中引入特殊的光學元件。例如，用于DIC的棱鏡和偏振鏡片，或用于熒光顯微鏡的二向色鏡和濾光片，對于相關技術而言都是必不可少的。在有限遠光學顯微鏡的物鏡和目鏡之間引入這樣的光學元件，改變了有效筒長，并引入了球面像差。這些可以通過引入額外的光學元件來校正，但代價是光強度較弱或放大倍數增加。

相比之下，無限遠校正光學顯微鏡可以容納用于多種觀察方法的額外元件，不會因將其引入到無限遠空間中而造成光學損失。安裝在無限遠光路中的裝置既不會改變成像比例，也不會改變中間圖像的位置。這是由于從標本的一個點射出的所有光線會平行穿過物鏡。

從無限遠光學中受益的不僅僅是整體圖像質量。由于將不同的光學裝置移動到無限遠光路時，放大倍數不會發生變化，因此可以很容易地使用不同的光學對比法來比較完全相同的樣品。例如，標本可以同時在DIC和熒光中成像（見圖3）。

圖3：DIC棱鏡或熒光濾鏡等光學裝置，進入有限遠光學的光路，損壞圖像質量。必須通過使用額外的光學元件來確定引入的像差。這會增加物體的放大倍數。而引入無限遠空間的光學元件對放大倍數沒有影響。因此，DIC圖像（左）和熒光圖像（中）可以同時接收（右）。

除了少數例外，大多數顯微鏡都有一個物鏡轉盤，在轉盤中，可以根據所需的放大倍數安裝并更換不同的物鏡。齊焦性允許用戶在不同的物鏡之間切換，而不需要重新聚焦標本。即使在無限空間中添加額外的光學儀器，也可以保持無限遠光學的齊焦性。

如何讓更多的裝置進入無限遠光路中

圖4：一些顯微技術要求同時耦合額外的光源或激光。例如，在FRAP實驗過程中，通過將激光耦合到無限遠光路中進行熒光漂白。

光學顯微鏡仍然是一個不斷發展的領域。新技術的開發需要使用顯微鏡的光路，例如包括額外光源或激光。其中，熒光漂白后恢復技術（FRAP）需要激光對熒光基團進行漂白（見圖4）。另一個例子是數字微鏡器件（DMD），用于光遺傳技術、光解籠鎖和光漂白/激活。

無限遠光學的引入為這些方法奠定了基礎，因為其簡化了必要組件通過無限遠空間耦合到顯微鏡光路的過程。

到目前為止，人們已經發明了新的方法，可以使額外的裝置進入到無限遠光路中。從技術上看，有兩種方式可以進入無限遠空間：在物鏡和鏡筒透鏡之間的成像路徑，或在物鏡和光源之間的照明路徑（見圖5）。通過成像路徑進入的優點是，電動快速濾光片輪和快門等專用模塊，可以非常容易地引入到顯微鏡中。

然而，應謹記，無限遠空間（盡管其名字與其含義相反）不能通過將模塊堆疊到顯微鏡中而無限延伸。原因是只有從標本中心射出的光線平行于光軸。

從標本一個點射出的偏離中心的光線彼此平行，但會以一定的角度照射到鏡筒透鏡上。從邏輯上講，擴大物鏡和鏡筒透鏡之間的成像路徑會導致光損失。更準確地說，這會引起漸暈，并縮小視野。

圖5：可以通過兩種方法獲取顯微鏡的無限遠光路：物鏡與管鏡筒透鏡（TL）之間的成像路徑（上），或光源（L）與物鏡之間的照明路徑（下）。前一種方法需要將相關模塊堆疊到顯微鏡中，從而延長了成像路徑。第二種方法允許用戶通過在照明路徑中利用反射鏡和分光器獲取顯微鏡上的多個應用。

徠卡DMi8無限遠端口

通過顯微鏡的照明路徑，例如通過徠卡無限端口，進入無限遠空間，可以避免延長成像光路的問題（見圖6）。除了保持圖像質量外，該特性還具有通用性強的優點。只要有正確的適配器，任何裝置都可以連接到顯微鏡上。特別是自己搭建設備的科學家，他們可以制造自己的裝置，并將自己的裝置與第三方設備和徠卡儀器連接，創建定制的成像解決方案。